研究意义：目前乳制品中的叶酸测定都是微生物培养法、固相萃取色谱测定法，由于方法的本身原因，样品处理困难，回收率低下，不确定因素多。本法针对上述问题进行了方法学的研究，简化了样品处理，大大提高了回收率，为食品检验提供了良好的借鉴。
具体的实验介绍如下：

仪器：安捷伦-1260型高效液相色谱仪；KQ-500E型超声仪。

试剂试药：甲醇（CNW 色谱纯）；纯化水；叶酸标准品（德国DR 叶酸工作标；批号：1203005-6

含量：99.0%）； 三乙胺；冰醋酸；已烷磺酸钠；

分析方法及条件：（HPLC法）

色谱条件

色谱柱：CNW ODS C₁₈柱，250mm×4.6mm,5μm.

流动相：取500ml去离子水，加10ml冰醋酸，6ml三乙胺，0.065g已烷磺酸钠，用去离子水定容至1L，过0.45μm滤膜，取上述溶液830mL与170ml甲醇混合，脱气.

流速：1.0ml/min  

柱温：35℃   

进样量：30µl

检测器：紫外检测器275nm

运行时间：25min

1、线性范围确认：

1.1试验方法：

叶酸标准贮备液的配制：精确称取叶酸约10 mg于50ml棕色容量瓶中，用0.1mol/ml碳酸钠溶解并定容至刻度，摇匀，浓度约为200μg /mL，放在4℃的冰箱中储存备用。

1.2标准工作曲线绘制：

精密吸取叶酸标准贮备液2.00mL于100mL棕色容量瓶中，加0.1mol/ml碳酸钠稀释至刻度，摇匀;吸取2.00ml到50ml棕色容量瓶中，即得叶酸标准使用液，经0.45μm的微孔滤膜过滤，取滤液分别进样5ul、10ul、15ul、20ul、25ul。

1.3试验数据：（色谱图见图1）

 

1.4试验结论：

线性评价：相关系数 R为0.99988,所以用该方法测定叶酸的含量，在浓度为0.0269ug/ml至0.1384ug/ml之间呈现良好的线性。

2、精密度试验： 

2.1叶酸标准贮备液的配制：精确称取叶酸约10 mg于50ml棕色容量瓶中，用0.1mol/ml碳酸钠溶解并定容至刻度，摇匀，浓度约为200μg /mL，放在4℃的冰箱中储存备用。

2.2精密称取约0.25g样品，置于25ml棕色容量瓶中，加0.1mol/ml碳酸钠5ml，超声15min使溶解，并用纯化水定容至刻度，摇匀，经0.45μm的微孔滤膜过滤，即为供试品溶液;

取滤液进样30ul。

2.3标准工作曲线绘制：

精密吸取叶酸标准贮备液2.00mL于100mL棕色容量瓶中，加0.1mol/ml碳酸钠稀释至刻度，摇匀;吸取2.00ml到50ml棕色容量瓶中，即得叶酸标准使用液，经0.45μm的微孔滤膜过滤，取滤液分别进样5ul、10ul、15ul、20ul、25ul。

2.4试验数据：（色谱图见图2）
 

2.5试验结论：6份样品含量的RSD（%）分别为：3.4%，其RSD（%）小于5.0%，表明该方法有较好的精密度。

3、回收率试验：

3.1试验方法：

对照品和样品的处理方法见精密度试验。

加标样品的处理：精密称取约0.25g样品6份，置于25ml棕色容量瓶中，分别加0.8ug/ml的叶酸对照液2.0ml，再分别加0.1mol/ml碳酸钠5ml，超声15min使溶解,并用纯化水定容至刻度，摇匀，经0.45μm的微孔滤膜过滤，作为加标溶液；取该加标溶液30ul进样。

3.2试验数据如下：【试验样品为：孕妇乳清蛋白粉（批号：20110901）】
 

  回收率试验结果表（色谱图见图4）

测得对照品投入量=加标样品测得量- 样品测得量      

回收率(%)=测得对照品投入量/投入量

3.3试验结论：孕妇乳清蛋白粉加标100%的回收率分别为99.91%、108.26%、106.14%、97.60%、102.06%、103.49%，平均回收率分别为：104.8 %、101.2%，相对标准偏差（RSD）分别为4.2%、2.9% ，均在可接受范围内(要求回收率在真实浓度的90.0%～110.0%,回收率的RSD值应≤5.0%)，结果均符合可接受标准。

4.样品中叶酸含量测定：

含量测定试验结果表（色谱图见图4）
 

试验结论：样品孕妇乳清蛋白粉（批号：20110901）叶酸含量为0.72mg/100g，符合规定，（质量标准要求为0.5～1.1mg/100g）【按工艺规程的配方计算理论含量为：0.69mg/100g，外检含量为：0.63mg/100g】。

5.结论：通过对叶酸的含量测定方法进行线性、精密度、回收率试验，证明含量测定方法科学有效，能对孕妇乳清蛋白粉中叶酸的含量起到质量控制的目的。